等温扩增荧光技术快速检测金黄色葡萄球菌方法的建立

一、摘要:

金黄色葡萄球菌是致病性和致死性的主要病原菌之一,尤其是耐药菌株,可引起局部化脓感染,也可引起肺炎、伪膜性肠炎和心包炎等,甚至败血症、脓毒症等全身感染。

传统的金黄色葡萄球菌检测技术依赖于培养,需要增菌和分离等步骤,最终通过镜检观察形态学和染色特征以及特定生化反应判定,如Baird-Parker平板涂布法、PetrifilmTM测试纸片法和Baird-Parker+RPF倾注法。各检测方法过程中均需要大量的实验材料,需要专业人员在设施完备的实验室才能进行检测。

本研究目的是应用新型核酸等温扩增技术建立金黄色葡萄球菌的快速检测方法,不但可在实验室进行检测,也可在实验室以外任何地点进行快速检测和筛查。时间短,前处理简单,与传统方法相结合,完善金黄色葡萄球菌的检测机制,为致病菌和食品安全检测提供技术支撑。

关键词:微生物,核酸,快速,检测

二、引言:

等温荧光扩增技术--Isothermal Amplification Fluorescent Method(IAFT)是核酸体外扩增和荧光法技术的结合,在恒温条件下进行,通过添加特殊的DNA聚合酶和特异性引物,在扩增的同时加入荧光基团,通过荧光信号累积实时监控扩增过程,实现核酸快速扩增和检测,并对产物做溶解曲线分析[1-2]。作为一种全新的快速鉴定方法,这种方法所需实验条件简单、前处理要求低、特异性强、扩增速度快,可广泛用于食源性微生物快速鉴定领域。

本研究针对金黄色葡萄球菌特异性的femA基因片段设计并筛选出了IAFT法的特异性引物,验证特异性和灵敏度,并与传统检测方法做对比,结果符合率为100%

三、实验仪器及材料:

材料:金黄色葡萄球菌菌液,藤黄八叠球菌菌液,大肠杆菌菌液

引物(5条)

IMM(optigene Limited公司)

细菌基因组核酸提取试剂盒(STP)

仪器:Optigene limited Genie Ⅲ

四、实验步骤:

1.引物稀释:将引物稀释成下表浓度:

FIP(上游内引物)40pmol/uL

BIP(下游内引物)40pmol/uL

F3(上游外引物)5pmol/uL

B3(下游外引物)5pmol/uL

LF(上游环引物)20pmol/uL

2.实验体系:

IMM15ul;引物 FIP、BIP、F3、 B3,LF 各1ul;样品5ul。

3.反应程序设定

65℃反应40min.

溶解曲线 98-80℃。0.05℃为一个循环

4.样本制备:

分别使用提取试剂盒和加煮沸法制备核酸同时检测,比对实验结果。试剂盒提取时参照试剂盒说明书,煮沸法取菌液1ml,95℃加热10分钟,离心取上清。

五、实验结果:

1.扩增曲线

 

图一:实验结果显示,只有金黄色葡萄球菌对应的1、2孔有阳性扩增,其他菌株和阴性对照均未出现扩增,结果特异。其中使用试剂盒提取的样本起峰时间较早,煮沸法的样本出峰时间较晚。


2.溶解曲线


 


图二:特异性溶解曲线分析,针对产物做温度退火同时检测荧光值,相同样本峰值重合。


综上所述,本研究通过金黄色葡萄球菌的基因分析和比对,设计和筛选特异性引物,优化样品前处理,确立实验程序和规范,完成特异性实验,常规方法比较,验证和建立了金黄色葡萄球菌的快速检测技术。

六、 讨论

核酸体外扩增技术如PCR等已成为分子生物学的常规实验方法和诊断技术,近年来陆续出现各类核酸等温扩增技术,对目的片段设计特异引物,使用新型DNA聚合酶在等温条件下复制和扩增,与传统PCR技术比较,更加灵敏、快速、特异,有多种结果分析和判定方法,如浊度法、钙黄绿素法、电泳法、实时荧光法。其中浊度和钙黄绿素法是基于副产物的间接判定方法,准确性和特异性欠佳。电泳判定依赖实验室环境,易交叉污染,假阳性率高。而实时荧光法以其准确、特异、快速和重复性好等特点被应用到越来越多的检测体系中。

本研究使用等温扩增荧光法 (IAFT)为基础建立了金黄色葡萄球菌的检测体系,与传统方法进行对比,其结果符合率达到100%。根据上述实验结果,样本仅需一步增菌即可上机进行检测,除了可以使用试剂盒提取纯度较高的核酸样本进行扩增和检测外,煮沸法抽提同样适用,克服了普通PCR和QPCR[3-5]对样本纯度要求高的缺陷,使未知样本的核酸现场快速检测得以实现,且准确率与传统方法一致。

七、 结论

1、 集成核酸等温扩增核心技术,以等温扩增荧光快速检测技术为基础建立了金黄色(IAFT)快速检测技术体系。

2、分析金黄色葡萄球菌及同源性较高的其他细菌的特异性核酸序列,经序列比对找到靶基因进行引物设计和筛选,保证所选引物对金黄色葡萄球菌核酸序列的扩增高度特异

3、 经与传统方法以及PCR法进行比价和评价,其准确率与传统培养法完全一致,且更为特异、敏感、精确、快速和便捷,适合于任何条件下的现场快速检测,可对由金黄色葡萄球菌和其他常见的致病微生物进行快速鉴定和诊断,可作为微生物检测的快速鉴定技术,推广和应用前景广阔。

参考文献:

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