人感染猪流感病毒核酸的(Swine Flu Virus---H1N1)Real Time PCR检

人感染猪流感病毒核酸(Swine Flu Virus--A H1N1)实时荧光定量PCR的检测方法

前言   

检测人感染猪流感病毒核酸(Swine Flue Virus—H1N1)是检测H1N1特异的诊断方法。应用实时荧光定量PCR检测该病毒核酸，是当前诊断该病病原的敏感、快速、特异的标准方法。病原检测选用RT-PCR仪器，是准确检出并做出正确结论的关键，针对实时荧光定量PCR分子诊断核酸检测技术的先进性及技术成熟性，根据RT-PCR检测技术使用的广泛性和美国CDC《针对人感染猪流感病毒治疗和预防的临时指南》、我国卫生部《人感染猪流感预防控制技术指南（试行）》，均规定“实时定量PCR (Real-time PCR)技术”为人感染猪流感实验室检测的确诊方法。因此，实时荧光定量PCR技术在人感染猪流感诊断中具有先进、快速、成熟、合法的特点，是一种国际规范的主流技术。

鉴于全球性的人感染猪流感对人类健康和公共卫生的危害和传播发展的趋势，世界卫生组织2009年4月29日晚已将全球流感大流行告级别从4级提高到5级，我国也起动了相应的应急预案，防控技术措施的关键是检测与诊断技术和仪器装备。

注：世界卫生组织(WHO)2009年4月30日宣布，从当日起该组织不再使用“猪流感”一词指当前的疫情，而开始使用“A (H1N1)型流感”一词。

实时荧光定量PCR技术在禽流感诊断中的应用

尽管本次人感染猪流感病毒基因序列仍需进一步确立，但本次疫情病原学基础明确，属于RNA病毒感染性疾病。回顾近年来感染RNA病毒的烈性传染病，如SARS、禽流感，世界卫生组织及我国卫生行和技术部门相继制定了较为成熟的实验室检测和诊断标准，其中我国颁布的应用实时荧光定量PCR方法进行实验室检测和快速诊断的标准如《GB/T 19438.1—2004禽流感病毒通用荧光RT—PCR检测方法》、《GB/T 19438.2—2004 H5亚型禽流感病毒荧光RT—PCR检测方法》、《GB/T 19438.3—2004 H7亚型禽流感病毒荧光RT—PCR检测方法》等，同时我们也注意到近年来国家针对食品安全尤其是乳品检测和食物致病菌检测的实时荧光定量PCR检测标准，如《SN/T 1632.3-2005 奶粉中阪崎肠杆菌检验方法：荧光PCR方法》和《SN/T 1870-2007 食品中致病菌检测方法：实时PCR法》。以上实时荧光定量PCR技术在禽流感及其它方面检测的国家标准是该技术在当前的人感染猪流感诊断中应用的基础和前提。

实时荧光定量PCR技术及在我国卫生应急中的应用要求  

实时荧光定量PCR技术（Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction简称Real Time PCR，如果用于RNA检测，这被称为逆转录实时PCR即Real-time RT-PCR）是实时PCR法，它是指对DNA或经过反转入（RT-PCR）的RNA通过聚合酶链式反应并实时监测DNA的放大过程，在扩增的指数增长期就测量扩增产物，因为扩增指数增长期测量值与特异DNA（RNA）起始量存在相关性，从而实现定量检测。Real Time PCR的基本目标是精确测量和鉴别非常微量的特异性核酸，从而可通过监测CT值而实现对原始目标基因的含量定量。目前被普遍使用的多种常规PCR方法如各种凝胶电泳PCR法，终点荧光定量法或PCR-ELISA法叫做终点PCR法。实时荧光定量PCR法最大的优点是克服了终点PCR法进入平台期或叫饱和期后定量的较大误差，实现DNA/RNA的精确定量。普通PCR技术发明于1983年，而实时荧光定量PCR技术发明于上世纪九十年代并于1996年生产出了世界上第一台实时荧光定量PCR仪，实时荧光定量PCR技术得以实现的技术要素主要有荧光定量PCR试剂盒和实时荧光定量PCR仪，我国荧光定量PCR试剂盒研发实力强大，生产厂家较多，临床诊断的品种如HBV/HCV及禽流感诊断试剂盒性能优良、供应充足，基本实现国产化。在猪流感病毒RNA核酸序列明确的情况下，利用现有的试剂研发平台，人感染猪流感实时荧光定量PCR诊断试剂盒很快就会面世。实时荧光定量PCR仪由于技术含量高，只有少数几家中国企业有能力生产如西安天隆科技有限公司生产的TL-988系列仪器不但取得了发明专利、国家科学技术奖、国家重点新产品证书、医疗器械注册证，而且被国家发改委确立为国家高技术产业化示范工程2008年生物医学工程专项，产品性能达到国际先进水平，在乳品检测行业市场占有率比进口仪器还高[1-3]。实时荧光定量PCR仪应用广泛，1999年开始，西方发达国家尝试将PCR应用于临床传染病诊断、食品安全检测以及血液筛查，目前已相当普及。2008年12月13日中国卫生部下发《卫生应急队伍装备参考目录》（卫办应急发[2008]207号），其中要求县级以上卫生应急队伍建设中必须配备PCR仪和实时荧光定量PCR仪作为传染病控制类装备。

实时荧光定量PCR技术在猪流感诊断中的作用已有法规确立

在人感染猪流感病毒出现以前，针对猪与猪传染的传统猪流感疫情，近年来我国科技人员经过不懈努力，探索快速检测与诊断方法，发表了一系列应用实时荧光定量PCR检测的研究论文[4-5]。

人感染猪流感疫情发生后，美国疾病预防控制中心（CDC）于2009年4月28日发布了针对人感染猪流感病毒治疗和预防临时指南，西安天隆科技有限公司在第一时间将其翻译成中文版本[6]。其中规定了确诊病例的诊断方法：具有急性发烧呼吸道疾病的临床症状并且经实时荧光定量PCR （real-time RT-PCR）或病毒分离培养 （viral culture）实验室检测方法检验证实感染A（H1N1）型猪流感病毒。卫生部办公厅于4月30日印发了《人感染猪流感预防控制技术指南（试行）》的通知》[7]，其中在实验室检测和病例诊断报告章节，内容如下：

检测程序

呼吸道标本应首先应用real time RT-PCR方法检测A型流感病毒的M基因、Swine（ H1N1）的HA基因和NP基因，以及质控对照RNP基因。同时，接种MDCK细胞或SPF鸡胚进行病毒分离，并测定病毒的全基因组序列。

推荐检测方法

1、首选方法：实时定量PCR (Real-time PCR)方法，用于检测猪流行性感冒（Swine Flu Virus—H1N1病毒核酸）。

2、其他检测方法：快速流感抗原检测、病毒培养、免疫荧光法（或装配的IFA ）

根据国际相关检测方法规范，上述卫生部法规中，与“其他检测方法”不同，实时定量PCR (Real-time PCR)方法被确定为人感染猪流感诊断的推荐检测方法。