传染性鲑鱼贫血症病毒实时荧光环介导等温扩增检测方法的建立

摘要 根据ISAV 的基因保守序列，利用LAMP Designer 软件设计了6 条引物，采用新型的环介导等温扩增设备进行扩增和检测，优化了反应条件，分析了所建立方法的特异性和灵敏度，并与RT-PCR 和实时荧光RT-PCR 进行比较。研究表明，该方法最适反应温度为64℃，反应10 min 就可以观察到明显的扩增。该方法灵敏度高，检测限为78.4 fg RNA，比常规RT-PCR 灵敏度高100 倍，与实时荧光定量RT-PCR 灵敏度相当；特异性好，与传染性胰腺坏死病毒(IPNV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、出血性败血症病毒(VHSV)、鱼类病毒性神经坏死病病毒(VNNV)、鱼腹水病毒(YAV)等14 种主要鱼类病毒没有交叉反应。结果表明，本研究建立了ISAV 的实时荧光环介导等温扩增检测方法，实验能对整个扩增过程进行实时监测，提高检测灵敏度的同时，防止由于开盖跑电泳或加染料而导致的污染。

关键词 传染性鲑鱼贫血症病毒；实时荧光环介导等温扩增；检测

传染性鲑鱼贫血症病毒(Infectious salmon anaemia virus，ISAV)是一种正粘病毒，直径100−130 nm，由8 条负链RNA 片段组成，该病毒具有凝血、受体破坏和融合的活性(Falk et al, 1997)，主要感染大西洋鲑鱼(Salmo salar)，可引起大西洋鲑鱼全身性和致死性的传染病——传染性鲑鱼贫血症(Infectious salmon anaemia，ISA) (Thorud et al, 1988)。该病的显著特征是严重贫血、程度不同的出血和多组织坏死。20 世纪80 年代中期，首次在挪威报道该病，随后1996 年加拿大的新布朗斯维克省、1998 年苏格兰、2000 年法罗群岛、2001 年智利和美国的缅因州等地相继暴发该病(Rimstad et al, 2002)。ISA 自然感染仅在养殖大西洋鲑鱼中有记录，但在2002 年，爱尔兰虹鳟(Oncorhynchus mykiss) 和智利银鲑(Oncorhynchuskisutch)也有分离到ISAV 的报道(Kibenge et al,2004)。近年来的资料显示，北极红点鲑(Salvelinus alpinus)、虹鳟、褐鳟(Salmo trutta)、大西洋鳕鱼(Gadus morhua)等均可以感染ISAV，而且目前宿主有扩大的迹象(Olsen et al, 2012)。

我国是渔业生产大国，2007 年水产养殖面积563.321 万hm2，产量3278.3 万t，均位居世界第一，近年来水产养殖病害普遍加重(张家松等, 2010；盖春蕾等, 2013；蔡林婷等, 2013)。虽然目前我国尚未有ISA 发病的报道，但随着我国鲑鳟鱼类养殖业的发展，进口大量的水生动物苗种，水生动物及其产品的进口贸易也急剧增加，特别是冰鲜大西洋鲑鱼大量进口到国内市场，ISA 随时会传入我国。诊断ISAV 的方法是细胞分离病毒后，用RTPCR、实时荧光定量RT-PCR 等分子生物学方法检测。环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术是日本荣研化学株式会社学者建立的一种新型核酸扩增方法(Notomi et al, 2000)。LAMP技术具有高效、快速等特点，广泛应用于动植物、人类病原体的检测，近年来在水生动物病原检测方面也有一定的应用。本研究建立了ISAV 的实时荧光LAMP 检测技术，为ISAV 的诊断提供了另一种快速、敏感、特异的检测方法。

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