荧光环介导逆转录等温扩增（RT-LAMP）技术在病毒性出血性败血症（VHS）诊断中的应用

摘　要：运用GenieII实时荧光等温扩增检测系统，以LAMP法荧光检测为基础，建立了对病毒性出血性败血症病毒进行荧光实时反转录环介导等温扩增检测方法。根据对VHSV病毒N基因序列的分析，针对病毒的高保守区域的6个特异性序列，设计了3对特异性引物，同时加入dsDNA混合染料，对核酸扩增过程进行实时荧光监控。该方法的特异性良好，与其他鱼类弹状病毒无交叉反应。敏感度高，检测限为20 fg RNA模板。实验结果表明该方法是一种操作简单、快速高效、高特异性高灵敏度的病毒检测方法。

关键词：病毒性出血性败血症病毒；荧光逆转录LAMP法；诊断

病毒性出血性败血症（v i r a l h a emo r r h a g i c septicaemia，VHS）是由弹状病毒引起鲑、鳟、狗鱼和大菱鲆等数十种鱼类的一种烈性传染病，表现为出血性败血症，致死率达90%~100%。本病主要流行于北半球，是世界动物卫生组织（OIE）要求须申报的疫病，我国将其列为二类疫病。

目前国际上检测病毒性出血性败血症病毒通常采用的方法是细胞培养分离病毒法、血清学方法、反转录聚合酶链反应法[1]以及酶联免疫吸附试验[2]。细胞培养分离VHSV法结果可靠，但是检测周期长，不适用于快速鉴别诊断，普通PCR方法操作繁琐，不能满足快速、敏感的检测要求。环介导等温扩增（LAMP）技术的问世解决了核酸诊断上出现的诸多难题[3]，以其高效性、高特异性和反应快速的特点被广泛应用于各种鱼类病原体。本文应用GENIE II等温扩增荧光检测系统对LAMP产物进行荧光检测，在扩增反应中加入特异性荧光双链集合染料，扩增物可做熔解曲线分析特异性。

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